Investigación de la bioactividad de los ácidos oligo-galacturónicos insaturados producidos a partir de residuos de manzana por las pectinasas Alcaligenes faecalis AGS3 y Paenibacillus polymyxa S4

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 15830 (2022) Citar este artículo

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La pectina es uno de los principales componentes estructurales de las frutas y una fibra no digerible hecha de unidades de ácido d-galacturónico con enlace α (1-4). Este estudio investiga la degradación microbiana de la pectina en los desechos de manzana y la producción de compuestos bioactivos. En primer lugar, se aislaron e identificaron las bacterias que degradan la pectina, luego se evaluó la actividad pectinolítica mediante DNS. Los productos fueron evaluados por TLC y LC-MS-ESI. Los efectos antioxidantes se investigaron mediante DPPH y los efectos anticancerígenos y la citotoxicidad se analizaron mediante MTT y citometría de flujo. En este estudio se introdujeron dos nuevos aislados bacterianos, Alcaligenes faecalis AGS3 y Paenibacillus polymyxa S4 con la enzima pectinolítica. El análisis de la estructura mostró que los productos de la degradación enzimática incluyen ácidos mono, di, tri y penta galacturónicos insaturados con 74 % y 69 % de RSA a 40 mg/mL para A. faecalis y P. polymyxa S4, respectivamente. Los resultados de las propiedades antitumorales en células MCF-7 por ensayo MTT, para productos de AGS3 y S4 a 40 mg/mL después de 48 h, mostraron una supervivencia del 7 % y 9 %, respectivamente. En la evaluación de citometría de flujo, los compuestos de AGS3 a 40 mg/mL fueron 100 % letales en 48 h y con respecto al aislado S4 causaron 98 % de muerte. La evaluación de citotoxicidad en células L-929 no mostró toxicidad significativa en células vivas.

A medida que crece la población de la Tierra, el incremento de la producción de alimentos para satisfacer las necesidades nutricionales siempre ha sido una de las principales preocupaciones de las sociedades humanas. Este aumento de la producción, junto con factores como la urbanización descontrolada y la falta de métodos adecuados de gestión y reciclaje de residuos, conduce a la acumulación de residuos en el medio ambiente, lo que provoca daños ambientales irreversibles1. Según la Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO), la producción de frutas y verduras en el mundo es de más de 1740 millones de toneladas, de las cuales entre el 10 y el 50 % se desperdicia en diferentes países. El valor del desperdicio de alimentos en el mundo se estima en US$ 1 billón anual. Los recursos utilizados para producir esa cantidad de alimentos desperdiciados son responsables de la emisión de 4,4 gigatoneladas de gases de efecto invernadero (equivalentes a CO2) al año, lo que convierte a los alimentos desperdiciados en el tercer productor mundial de gases de efecto invernadero después de China y Estados Unidos2.

El alcance de las pérdidas de alimentos varía en las diferentes etapas de la cadena de producción según el tipo de producto, el nivel de desarrollo económico y las condiciones sociales y culturales de un área geográfica. En el caso de las frutas y hortalizas, según el estudio de la FAO, en las zonas industriales predominan los desperdicios en las etapas de recolección, selección y clasificación. En las áreas en desarrollo, mientras que la pérdida de alimentos es alta durante las etapas de cosecha, selección y clasificación, la cantidad de desperdicio durante la etapa de procesamiento (14–21 %) es mucho mayor que en las áreas desarrolladas (menos del 2 %)2,3. Esto es mientras que la mayoría de los productos de frutas se procesan antes del consumo, por lo que además de aumentar el valor, también se mantiene la calidad y la cantidad de frutas en el mercado4. Grandes cantidades de residuos se acumulan durante el procesamiento, lo que impone altos costos de tratamiento para reducir el detrimento ambiental5,6. Así, los residuos del procesamiento de frutas no solo representan cantidades significativas de desperdicio de alimentos, lo que significa un daño ambiental grave, sino que también indican la pérdida de nutrientes de alto valor7. Por lo tanto, la conversión de residuos en productos de valor agregado es importante y necesaria para mejorar la sostenibilidad y eficiencia de la cadena de suministro de alimentos8.

A lo largo de los años, en numerosos estudios, la producción de productos de valor agregado, a través de la conversión microbiana o procesos enzimáticos de desechos de frutas como enzimas, bioetanol, ácidos orgánicos, heteropolisacáridos, compuestos aromáticos, alimentos fortificados con proteínas, oligosacáridos prebióticos y compuestos bioactivos , ha sido investigado9. El procesamiento microbiano de las fibras residuales de la fruta es un enfoque relativamente nuevo que utiliza desechos como monómeros para la síntesis de oligómeros beneficiosos naturales10.

En general, la estructura de la fruta está compuesta por varios compuestos con diferentes propiedades. Después del agua, la mayor abundancia pertenece a los carbohidratos, que constituyen del 50 al 80 % del peso seco en la mayoría de las frutas11. Una gran cantidad de carbohidratos en los desechos de frutas son tipos de fibra dietética, de los cuales la pectina constituye hasta el 40% de los compuestos12. Las pectinas son una familia de polisacáridos ácidos de alto peso molecular, abundantes en la pared celular primaria de las plantas, compuestas principalmente de unidades de ácido d-galacturónico en la cadena principal con enlace α (1-4) junto con pequeñas cantidades de ramnosa en la cadena principal y arabinosa, galactosa y xilosa en las cadenas laterales10,13. Varios estudios han demostrado las aplicaciones de la pectina en la industria alimentaria y farmacéutica. Los estudios han sugerido que las pectinas de cadena corta tienen aplicaciones más amplias, como prebióticos, agentes anticancerígenos, sistemas de administración de fármacos, propiedades de eliminación de radicales, reducción del colesterol, etc., y esas características están relacionadas con la estructura y el peso molecular de los compuestos pécticos10 ,14.

Las especies radicales están asociadas con la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), asma, diabetes, inflamación, enfermedad cardiovascular e infarto de miocardio. Se considera que los antioxidantes sintéticos comúnmente utilizados en los procesos de fabricación son la causa de la citotoxicidad. Por otro lado, los polisacáridos naturales se consideran antioxidantes confiables que pueden eliminar los radicales libres y superar las sustancias sintéticas que plantean problemas de salud. Los compuestos ricos en ramnogalacturonano I, así como los compuestos que consisten en homogalacturonano en la cadena principal y ramnogalacturonano I y arabinogalactano en las cadenas laterales muestran el nivel más alto de propiedades antioxidantes; Por lo tanto, las propiedades antioxidantes de los compuestos pécticos pueden atribuirse a la estructura de ramnogalacturonano I, homogalacturonano y arabinogalactano15. Los ácidos oligogalacturónicos derivados de pectina, modificados por varios tratamientos, también pueden purificar compuestos que incluyen anión superóxido, hidroxilo y especies reactivas de oxígeno. También aumentan las propiedades antioxidantes de las enzimas: superóxido dismutasa, catalasa y glutatión peroxidasa y muestran propiedades antioxidantes al aumentar la cantidad de glutatión16.

Otra actividad biológica prometedora de la pectina es su papel potencial en la prevención y reducción de la carcinogénesis. Los efectos positivos de la "pectina modificada", ya sea en forma de productos comerciales como pectina cítrica modificada (p. ej., GCS-100, FPP o pectasol) o pectina modificada en laboratorio, han sido estudiados y probados. La pectina modificada de cítricos (MCP) en particular ha sido y es objeto de una amplia investigación17. No todos los MCP son iguales porque el término se usa para describir los polisacáridos solubles en agua derivados de la pectina producida a partir de la cáscara y la pulpa de los cítricos tratados con alta temperatura, alto pH o descomposición enzimática. La pectina cítrica de pH modificado tiene un peso molecular reducido y se deriva de la pectina cítrica comercial y tiene cadenas laterales ricas en galactosa que son capaces de unirse a la proteína prometastásica galactina-3 e inhibir la metástasis de células tumorales. La galactina-3 juega un papel clave en varios procesos fisiológicos y patológicos intracelulares, incluida la proliferación de células tumorales y la apoptosis. La unión de MCP a galactina-3 puede inhibir los efectos negativos de galactina-3, como inhibir su capacidad para promover la adhesión y migración de células tumorales y prevenir la apoptosis. Además de las cadenas laterales ricas en galactosa, la parte homogalacturonana de la pectina también tiene actividad anticancerígena. Fragmentos de pectina de bajo peso molecular (1 kDa) ricos en ácido galacturónico fueron absorbidos por células cancerosas humanas y de ratón, lo que inhibió el crecimiento de estas células y condujo a la liberación de lactato deshidrogenasa y galactina-3 de ellas. Además de interactuar con la galactina-3, se han informado algunos otros posibles efectos anticancerígenos de las pectinas modificadas tanto en condiciones in vitro como in vivo18. El polvo de pectina fraccionada de cítricos (FPP) de bajo peso molecular producido por hidrólisis en autoclave o una combinación de calentamiento e hidrólisis enzimática también induce la apoptosis de células de cáncer de próstata andrógeno e independiente de andrógeno. Las MCP producidas por la degradación enzimática del pectasol, indujeron la apoptosis en las células de cáncer de próstata y aumentaron el tiempo de duplicación del antígeno prostático específico (PSA) en pacientes sometidos a diversos tratamientos utilizados para tratar el cáncer de próstata. También se ha demostrado que la pectina cítrica hidrolizada enzimáticamente tiene beneficios clínicos, mejora la calidad de vida y reduce el dolor en pacientes con tumores avanzados en varios tipos de cáncer19.

Las pectinas se pueden degradar a oligosacáridos pécticos (POS) mediante varios métodos de degradación, como hidrólisis enzimática, hidrólisis ácida, procesamiento hidrotérmico, microfluidización a alta presión o reacción fotoquímica en medio que contiene TiO210,20. Los métodos enzimáticos tienen ventajas significativas sobre otros métodos, tales como: (1) la reacción se realiza bajo condiciones de operación suaves, (2) el medio de hidrólisis no causa corrosión, (3) no se usan químicos tóxicos o contaminantes (4) la hidrólisis es selectivo y afecta solo a unidades o enlaces constituyentes específicos, como se espera para una reacción catalizada por enzimas; (5) la eficiencia de la reacción puede ser superior a la que se puede lograr mediante métodos químicos y (6) se evita la formación de productos no deseados21. Las enzimas pectinolíticas se clasifican en dos grupos principales: (a) esterasas, incluida la pectina metil esterasa, y (b) despolimerasas, incluidas la hidrolasa y la liasa22. Muchas especies de hongos pueden descomponer la pectina al producir diferentes enzimas pectinolíticas. Los estudios han demostrado que Alternaria sesami produce enzimas pectinolíticas que incluyen poligalacturonasa transeliminasas, pectina transeliminasas y poligalacturonasas23. Elrod informó por primera vez que la bacteria Erwinia podía degradar la pectina23. Zucker et al.24 y Chatterjee et al.25 demostraron la producción de endopoligalacturonasa extracelular e inducida por Pseudomonas fluorescens y Erwinia.

Alcaligenes faecalis como miembro de Alcaligenaceae de la clase Betaproteobacteria tiene muchas aplicaciones en biotecnología e industrias de alimentos y salud. Alcaligenes spp. se ha utilizado en la producción de material de almacenamiento similar al plástico, enzimas, polisacáridos y también en la producción comercial de aminoácidos como aditivos alimentarios26.

Como miembro de Paenibacillaceae de la clase Bacilli, Paenibacillus polymyxa participa en una variedad de procesos fisiológicos y biotecnológicos. Se pueden usar diferentes cepas de esta bacteria en la fijación de nitrógeno, la producción de antibióticos y la solubilización de fósforo en el suelo. Se sabe que P. polymyxa produce enzimas que degradan la pared celular con vías hidrolíticas. Se informó que diferentes cepas de P. polymyxa producen exopolisacáridos (EPS) que, como metabolito secundario, tienen una amplia gama de aplicaciones en bioindustrias27.

En el estudio actual se aislaron e identificaron A. faecalis, AGS3 y P. polymyxa S4. El objetivo de este estudio fue investigar la degradación microbiana de pectina por pectinasa de aislados bacterianos A. faecalis AGS3 y P. polymyxa S4 y por primera vez identificar productos y luego investigar las propiedades anticancerígenas y antioxidantes de los compuestos obtenidos.

Aísla AGS3, gramnegativo, no ácidorresistente, aeróbico, en forma de bastón, catalasa positivo, oxidasa positivo, citrato positivo y móvil y S4 grampositivo, no ácidorresistente, aeróbico, en forma de bastón, Se seleccionaron catalasa negativa, oxidasa negativa, citrato negativa y no móviles (Fig. 1b) de acuerdo con su radio de área de halo claro (Fig. 1a). Las condiciones óptimas de crecimiento para ambos aislamientos fueron 30 °C y pH 6,8–7,0. Los resultados del análisis filogenético que se realizó utilizando el método de máxima verosimilitud mostraron que el aislado AGS3 pertenece al filo Proteobacteria, familia Alcaligenaceae y género Alcaligenes, y S4 era miembro del filo Firmicutes, familia Paenibacillaceae y género Paenibacillus (Fig. 1c). Además, el análisis BLAST reveló que los aislamientos AGS3 y S4 pertenecían a las especies Alcaligenes faecalis y Paenibacillus polymyxa respectivamente. A partir de entonces, la secuencia de los aislados A. faecalis AGS3 (MZ093052) y P. polymyxa S4 (MZ596260) se envió a GenBank, el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI).

( a ) Área de halo alrededor de aislados bacterianos seleccionados, AGS3 y S4, que muestra actividad pectinolítica por degradación del ácido poligalacturónico (áreas de halo amarillo). ( b ) Imagen microscópica de aislamientos bacterianos AGS3 y S4. ( c ) Relaciones filogenéticas del aislado AGS3 de A. faecalis y el aislado S4 de P. polymyxa. El árbol se construyó con el software MEGA 11 utilizando el método de máxima verosimilitud con 1000 bootstraps.

Alcaligenes faecalis es mejor conocido por la respiración anaeróbica con nitrito y la degradación de polímeros de reserva microbianos como el poli-(3-hidroxibutirato) (PHB). A. faecalis también se ha utilizado en la producción de aminoácidos no estándar. Aunque se reconoce que A. faecalis tiene una variedad de enzimas hidrolíticas que pueden usarse en la biodegradación de desechos vegetales, el estudio sobre su potencial necesita más progreso26.

Paenibacillus polymyxa es reconocido por producir una amplia variedad de metabolitos secundarios, lo que le permite resistir diversos estreses ambientales y lo convierte en un agente biotecnológico auspicioso en la agricultura y los procesos industriales. P. polymyxa tiene la capacidad de fijar nitrógeno, así como la producción de factores reguladores del crecimiento de las plantas, enzimas hidrolíticas y compuestos antibióticos. Las cepas de P. polymyxa son conocidas por producir varias enzimas hidrolíticas, incluidas proteasas, β-1,3-glucanasas, celulasas, xilanasa, lipasa, amilasa, quitinasas y pectinasa. Por lo tanto, varios estudios investigaron la capacidad de las cepas de P. polymyxa en la gestión de residuos y el tratamiento de aguas residuales. Sin embargo, los compuestos producidos por la actividad hidrolítica de las enzimas de P. polymyxa aún no se han identificado y necesitan más investigación27.

El ensayo de degradación de pectina se empleó utilizando el reactivo DNS para determinar el número de oligosacáridos pécticos (POS) producidos por la actividad pectinasa de los aislados A. faecalis AGS3 y P. polymyxa S4. Los resultados de la determinación del mayor rendimiento de liberación de POS mostraron que los aislados de A. faecalis AGS3 (Fig. 2a) y P. polymyxa S4 (Fig. 2b) tienen su concentración máxima de azúcares liberados después de 20 h y 4 h de incubación a 30 ° C, 180 rpm respectivamente.

Supervisión de la cantidad de oligosacárido péctico liberado de (a) aislado de A. faecalis AGS3 y (b) aislado de P. polymyxa S4, en medio de cultivo de pectina: 30 °C, 180 rpm.

Al final, los POS obtenidos se liofilizaron y almacenaron para su posterior análisis.

Se realizó cromatografía en capa fina (TLC) para verificar la degradación de la pectina por parte de los aislados. Los patrones de TLC confirmaron la degradación de la pectina a POS en ambos aislados (Fig. 3a). El análisis adicional de los ácidos oligogalacturónicos producidos se implementó mediante LC-ESI-MS de muestras liofilizadas. Los espectros de masas LC-ESI-MS de las fracciones de productos de aislamientos de A. faecalis AGS3 y P. polymyxa S4 mostraron que diferentes tipos de ácidos oligogalacturónicos estaban presentes en los productos enzimáticos de la degradación de pectina en ambos aislamientos (Fig. 3b, c, Tabla 1 ). Al final, se identificaron formas de ácido mono galacturónico y ácido mono, di, tri y penta galacturónico insaturado. Hay diferentes tipos de enzimas pectinolíticas. Entre ellos, la reacción realizada por la pectina liasa produce oligogalacturonatos insaturados, por lo tanto, considerando los productos obtenidos en este estudio, se supone que la actividad pectinolítica de los aislados de A. faecalis AGS3 y P. polymyxa S4 se debe a la enzima pectina liasa.

(a) Patrones de evaluación de TLC de muestras obtenidas de la actividad pectinolítica de aislados, S1: solución estándar de glucosa, S2: oligosacárido péctico obtenido de A. faecalis AGS3, S3: oligosacárido péctico obtenido de P. polymyxa S4, S4: solución estándar de ácido monogalacturónico; Espectros de masas LC-ESI-MS de muestras obtenidas de la degradación de pectina por (b) A. faecalis AGS3 y (c) P. polymyxa S4.

En general, la mayoría de las pectinasas reportadas pertenecen a hongos como Aspergillus, Alternaria y Penicillium28,29,30,31. Sin embargo, ha habido informes que muestran varios tipos de enzimas pectinolíticas en las bacterias; por ejemplo, se ha informado que Acinetobacter guillouiae, Kosakonia sacchari y Bacillus vallismortis tienen poligalacturonasas. Se ha demostrado la presencia de pectina y pectato liasas en especies de Streptomyces, Actinomycetes, Pseudomonas y Bacillus31,32. Hay algunos patógenos endófitos como Xanthomonas compestris, Ervinia chrysanthemi, Colletotrichum lindemuthianum, Pseudomonas siringea y Phytophthora capsici que tienen actividad pectinolítica31. Los estudios sugieren que algunos patógenos entéricos, como Salmonella y Escherichia coli, a pesar de su falta de enzimas pectinolíticas, son capaces de utilizar oligómeros que resultan de la degradación de la pectina10,31. Creemos que este estudio es el primero en identificar compuestos obtenidos a partir de la actividad pectinolítica de A. faecalis y P. polymyxa.

La actividad de captación de radicales (RSA) de los POS obtenidos se analizó mediante el reactivo DPPH. Los resultados para un rango de concentraciones de 1,25 a 80 mg/mL revelaron que los efectos antioxidantes de los POS aumentan al aumentar sus concentraciones. RSA de POS obtenido del aislado AGS3 de A. faecalis varió de 18 a 81 % para concentraciones de 1,25 a 80 mg/ml, y los resultados para P. polymyxa mostraron un rango de RSA de 13 a 74 % para las mismas concentraciones (Fig. 4 ).

Evaluación de las propiedades antioxidantes de los oligosacáridos obtenidos a partir de la degradación de pectina mediante el reactivo DPPH.

El estrés oxidativo es un concepto que se asocia con la pérdida del equilibrio entre prooxidantes y antioxidantes y está relacionado con la fisiología de enfermedades comunes. Los antioxidantes tienen su papel en la neutralización de formas reactivas de oxígeno con un impacto negativo en las células vivas33. Yeung et al.34 utilizaron la reacción de Fenton para hidrolizar la pectina de okra y encontraron que la actividad antioxidante del POS obtenido depende de la concentración. Los resultados del ensayo DPPH de POS obtenidos por hidrolización enzimática de Streptomyces hidrogenasas YAM1 mostraron que RSA aumenta en concentraciones más altas. Hosseini Abari et al.10 también demostraron que la pectina modificada enzimáticamente tiene más actividad antioxidante en comparación con los polisacáridos pécticos no tratados. Estudios similares corroboran la dependencia de la dosis de la actividad antioxidante de los POS. En este estudio, como se muestra en la Fig. 6, con respecto al incremento de las propiedades antioxidantes de las muestras por concentración, el RSA más alto se reportó en 80 mg/mL de muestras obtenidas de A. faecalis AGS3 y P. polymyxa S4. En 20 mg/mL de POS, los resultados fueron del 59 % para P. polymyxa S4 y del 69 % para A. faecalis AGS3, lo que mostró un aumento del 20–30 % en RSA, en comparación con los ácidos poligalacturónicos, como se menciona en Hosseini Abari et al. estudiar10. Estos resultados muestran un incremento significativo en RSA de POS en comparación con los resultados de la actividad antioxidante de los polisacáridos pécticos de estudios previos. Este es el primer informe de RSA en productos de las especies A. faecalis y P. polymyxa.

Una evaluación realizada por ensayo MTT y citometría de flujo mostró una actividad anticancerígena significativa en células MCF-7 para POS obtenidas de desechos de manzana utilizando enzimas pectinolíticas de aislados de P. polymyxa S4 y A. faecalis AGS3. Como se menciona en la Fig. 5, los resultados del ensayo MTT mostraron una reducción máxima de la viabilidad celular a 40 mg/mL de POS obtenidos de A. faecalis AGS3 y P. polymyxa S4 con 93 % y 91 % respectivamente después de 48 h de incubación. La reducción mínima de la viabilidad celular se obtuvo a 1.25 mg/mL de POS después de 24 h de tratamiento con 17% y 37% para A. faecalis AGS3 y P. polymyxa S4, respectivamente.

Evaluación de MTT de células MCF-7 después del tratamiento durante (a) 24 h y (b) 48 h.

Asimismo, los resultados del análisis de citometría de flujo a 5 y 40 mg/mL de los POS obtenidos después de 48 h de incubación demostraron inducción de apoptosis, con un 84 % y 100 % para A. faecalis AGS3, y un 90 % y 98 % para P. polymyxa S4 ( Figura 6b). En la Fig. 6b, la zona M1 representa la distribución de células vivas, no teñidas con el reactivo PI, y la zona M2 muestra las células muertas, teñidas con el reactivo PI. Como es visible en la Fig. 6a, las células tratadas también estaban sujetas a cambios morfológicos.

Los resultados de viabilidad celular de MCF-7 después de 48 h de tratamiento con 5 y 40 mg/mL de POS obtuvieron A. faecalis AGS3 y P. polymyxa S4, donde (a) muestra los aspectos morfológicos de las células tratadas en comparación con las células de control (no tratadas) y (b) demuestra el análisis de citometría de flujo de las células tratadas, en comparación con las células de control (no tratadas).

El cáncer como uno de los problemas de salud más importantes en el mundo, tiene numerosos inductores fisiológicos y bioquímicos llamados carcinógenos. La mayoría de las drogas sintéticas utilizadas en los tratamientos quimiotrópicos debido a sus efectos secundarios sobre las células no cancerosas y la resistencia a los medicamentos de las células cancerosas pueden originar más problemas para los pacientes, por lo que el uso de compuestos naturales con altas propiedades anticancerígenas se ha convertido en una solución superior10,13,35 . Los estudios han demostrado que los fragmentos de pectina cítrica hidrolizados enzimáticamente pueden afectar la progresión del cáncer de próstata proliferativo al reducir el PSA sérico en un 50 % después de 14 meses de tratamiento. Se ha demostrado que las pectinas de cítricos y manzanas tratadas enzimáticamente pueden inhibir el crecimiento e inducir la apoptosis en células cancerosas intestinales humanas19. La pectina de manzana modificada de bajo peso molecular inhibe el ciclo celular en tumores colorrectales en células de cáncer colorrectal humano (HT-29) in vitro y cáncer colorrectal asociado a colitis en ratones36. La misma pectina de manzana de bajo peso molecular redujo el riesgo de tumores de cáncer de colon en ratones y se informó que se unía a la galactina-318. El examen de la composición de monosacáridos mostró que el ácido galacturónico era el componente principal de la estructura de pectina modificada y solo se encontraron pequeñas cantidades de galactosa en ella; sin embargo, la composición de monosacáridos es similar a la de los monosacáridos de pectasol. Si bien la MCP puede no ser rica en galactooligosacáridos, puede absorberse selectivamente en el intestino delgado en comparación con los ácidos oligogalacturónicos37. En el estudio de Delphi et al. en células cancerosas MDA-MB-231, el tratamiento con POS indujo apoptosis y redujo la supervivencia de las células cancerosas38. Los resultados de la medición del efecto de los oligosacáridos y polisacáridos pécticos en la línea celular de cáncer HT29 por parte de Li et al.39 mostraron que los POS son más efectivos para inhibir las células cancerosas en concentraciones mucho más bajas que la pectina. Hosseini Abari et al.10 demostraron una apoptosis del 92 % de la línea celular MCF-7 después de 24 h de tratamiento con 20 mg/mL de POS, que fue significativamente mayor que el efecto de la pectina en la misma concentración. Apoyando los resultados anteriores, nuestro estudio obtuvo oligosacáridos que mostraron propiedades anticancerígenas significativas para las muestras de P. polymyxa S4 y A. faecalis AGS3. Hasta donde sabemos, no hay informes previos de propiedades antitumorales para productos de las especies P. polymyxa y A. faecalis.

Los efectos de citotoxicidad de los POS obtenidos en células L-929 se determinaron después de 48 h de incubación mediante ensayo MTT. Las células L-929 se trataron con 5 y 40 mg/ml de los productos obtenidos y las células no tratadas se usaron como control. Como se menciona en la Fig. 7a, el análisis no mostró toxicidad significativa para A. faecalis AGS3 con menos del 3 % de muerte y P. polymyxa S4 con alrededor del 2 % de muerte. La morfología de las células tratadas, como se muestra en la Fig. 7b, confirmó los resultados del ensayo MTT.

Evaluación de la citotoxicidad de los POS obtenidos en células L-929 después de 48 h de incubación. (a) Los resultados del ensayo MTT de las células tratadas no mostraron una citotoxicidad significativa en comparación con el control. (b) El análisis microscópico de las células tratadas no mostró cambios en la morfología de las células en comparación con el control.

La citotoxicidad de los fármacos utilizados en el tratamiento del cáncer en células no cancerosas es una preocupación importante en los tratamientos quimiotrópicos. En oposición a los resultados anteriores de Delphi et al. que mostró toxicidad en altas concentraciones de POS en células HUVEC, en el estudio actual después de 48 h de tratamiento de células L-929 con 40 mg/mL de POS, no se observó toxicidad significativa38. Según nuestra información, ningún otro estudio investigó la citotoxicidad del POS obtenido de A. faecalis y P. polymyxa.

Como resultado de este estudio, se aislaron e identificaron dos nuevos aislamientos bacterianos, Alcaligenes faecalis AGS3 y Paenibacillus polymyxa S4. Los aislados mencionados fueron capaces de degradar la pectina a una variedad de oligosacáridos pécticos insaturados. En este estudio, por primera vez, se investigó la bioactividad de los compuestos obtenidos de la actividad pectinolítica de las especies A. faecalis y P. polymyxa, y los resultados mostraron propiedades antioxidantes y anticancerígenas significativamente más altas a pesar de no ser tóxicos para las células vivas. La exquisita bioactividad de los compuestos obtenidos, junto con la capacidad de eliminar los desechos de frutas del medio ambiente, los convierte en una gran solución económica y ambiental a un problema creciente en el mundo.

En este estudio se utilizaron desechos del cultivar Golden Delicious de manzana (Malus domestica). Los desechos mencionados se compraron en el mercado local de frutas de la frutería Bahar, Isfahan, provincia de Isfahan, Irán. Las manzanas se pelaron y se cortaron en cubos de 3 mm, luego se agregaron 30 g de los desechos de manzana picada a una solución que consistía en jugo de limón (12,5 ml), ácido cítrico (0,1 g) y 150 ml de agua destilada. La mezcla se hirvió en el calentador durante 30 min y luego se filtró a través de un paño de algodón. Después de enfriar a temperatura ambiente, a la solución filtrada se le añadieron 30 mL de alcohol etílico al 96% y luego se puso a 4 °C durante una hora para que tomara forma gelificante. El sobrenadante de la mezcla se descartó luego de centrifugar por 10 min a 800 g. Finalmente, el sedimento que contenía la pectina extraída fue liofilizado40.

Se recolectaron muestras de suelo de 12 áreas diferentes como fuente de aislamiento. Las muestras se disolvieron y mezclaron bien durante una hora en solución de Ringer, luego se cultivaron en medio de agar nutritivo que contenía 0,25 ml de clotrimazol al 1 % en 100 ml de agua destilada. Luego, los aislados seleccionados se cultivaron en medio de agar con pectina que contenía pectina extraída (0,5 g), extracto de levadura (0,1 g), peptona de caseína (0,5 g), CaCl2 (0,2 g), NaCl (0,2 g) y agar (1,5 g). en 100 mL de agua destilada41. Después de 24 h a 30 °C, las colonias degradantes de pectina se diferenciaron mediante la medición de su área de halo transparente como resultado de la adición de una solución de reactivo I/KI al 1 % a las placas42. Se seleccionaron e identificaron aislamientos AGS3 de suelo de jardín y S4 de suelo forestal. Los pares de cebadores universales, 27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) y 1492R (5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′) se usaron como cebadores directos e inversos respectivamente para amplificar el gen 16S rRNA y luego Bio Magic Gene realizó el procedimiento de secuenciación. (BMG) Compañía, China. Las secuencias se enviaron a GenBank, NCBI y se investigó el historial de relaciones evolutivas utilizando el método de árbol de máxima verosimilitud en el software MEGA 11. La secuencia de ADNr 16S de la cepa YS4 de Streptomyces maltophilia se utilizó como grupo externo (MT071635.1).

La degradación de pectina se determinó mediante el análisis cuantitativo de azúcares reductores por ácido 3,5-dinitrosalicílico (método DNS). Después de la inoculación de aislados bacterianos al medio de caldo de pectina que contiene pectina extraída (0,5 g), extracto de levadura (0,1 g), peptona de caseína (0,5 g), CaCl2 (0,2 g) y NaCl (0,2 g) en 100 ml de agua destilada , se extrajeron 4 mL de medio bacteriano en condiciones estériles cada dos horas. Luego, la masa bacteriana se separó del medio mediante centrifugación a 2400 g durante 5 min. Se añadió 1 ml de reactivo DNS a un tubo con tapón de rosca que contenía sobrenadante de cultivo, y los tubos de reacción se hirvieron durante 5 min y se enfriaron a temperatura ambiente. Se añadió 1 mL de sulfato de sodio al 0,5% a los tubos de ensayo para obtener un color estable y se leyeron los valores de absorbancia a 540 nm43.

Se usó cromatografía de capa fina (TLC) para detectar productos de degradación de pectina. Se colocaron 1,5 μL de los sobrenadantes de cultivo como muestra, una solución 1 mM de ácidos monogalacturónicos y una solución 1 mM de glucosa como soluciones estándar (adquiridas de Sigma) en gel de sílice 60 F254 (Merck). La cromatografía se realizó tres veces en n-butanol/ácido acético/agua (2:1:2) como fase móvil. La visualización de las manchas secas sobre gel de sílice se realizó mediante la pulverización del reactivo orcinol/ácido sulfúrico (8 mg de orcinol en 10 ml de ácido sulfúrico al 70 %). Luego, las placas se calentaron a 100 °C durante 10 min32.

Los productos de degradación de pectina obtenidos fueron analizados e identificados por LC-ESI-MS. Se disolvieron 2 mg de cada muestra en 100 μL de agua destilada y se investigó la fracción soluble de las muestras. La investigación se realizó isocráticamente mediante una mezcla de agua y acetonitrilo (90:30) como fase móvil y el caudal se fijó en 0,3 mL/min. Se utilizó un sistema LC Agilent serie 1100 que consta de una bomba de administración cuaternaria, un compartimento de columna termostatizado, un desgasificador (Agilent Technologies, Alemania) y una válvula inyectora manual Rheodyne 7725i con un bucle de muestra de 20 µL (Cotati, CA, EE. UU.) para preparar una muestra y la espectrometría de masas se llevó a cabo con el espectrómetro de masas triple cuadrupolo Agilent 6410 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, EE. UU.) que fue ejecutado por Agilent MassHunter Workstation B.01.03. La ionización se logró utilizando ionización por electropulverización (ESI) en modo negativo con un voltaje capilar de 4000 V. Se utilizó nitrógeno como gas nebulizador con una presión de nebulización de 40 psi y una temperatura de fuente de 100 °C. El nitrógeno se calentó a 300 °C y se suministró a un caudal de 10 L/min. El voltaje del fragmento para las muestras fue de 280 V y el tiempo de permanencia fue de 200 ms. El analito se detectó utilizando el modo de exploración32.

Los efectos antioxidantes de los oligosacáridos pécticos obtenidos se evaluaron a varias concentraciones que oscilaban entre 1,25 y 80 mg/ml. Se añadieron 0,5 mL de POS a 2 mL de solución metanólica 0,2 mM de 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH). Los tubos de reacción se colocaron durante 30 min a 25 °C en oscuridad. Posteriormente, se examinó la absorbancia de las muestras a 517 nm. El control de la reacción fue DPPH 0,2 mM y se usó etanol al 60% como blanco. Sobre la base de la absorbancia medida, la actividad eliminadora de radicales (RSA) se calculó mediante la ecuación. (1)44:

La línea celular MCF-7 de cáncer de mama humano (adquirida en el banco de células de la Universidad de Isfahan) se cultivó en medio COM elaborado con medio mínimo de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; BioIdea), con un 10 % de suero fetal bovino (BioIdea) y un 1 % de penicilina –solución de estreptomicina (Sigma, EE. UU.)45.

Se usó el ensayo MTT (bromuro de (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) para analizar la viabilidad celular. Las células se sembraron en placas de cultivo de 96 pocillos a una densidad de 10.000 células por bien y se incubaron en una incubadora de CO2 a 37 °C en 5% de CO2 y 95% de humedad durante 24 h. Al día siguiente las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7), se trataron con 5 y 40 mg/mL concentración de pectina y obtuvo POS durante 24 y 48 h Además, en los puntos de tiempo respectivos, se agregaron 20 μL de solución de MTT (5 mg/mL) a los pocillos y las células se incubaron en una incubadora de CO2 en la oscuridad durante 4 h. Se eliminó el medio y se disolvieron los cristales de formazán formados por las células usando 100 µl de dimetilsulfóxido (DMSO).La viabilidad celular se midió usando un lector multimodo a 570 nm y se calculó como Ec. (2)46:

Las células se recogieron en placas de cultivo de 24 pocillos a una densidad de 100.000 células por pocillo y se incubaron en un incubador de CO2 durante 24 h. Las células se lavaron con PBS y se trataron con concentraciones de 5 y 40 mg/mL del POS obtenido durante 24 y 48 h. A partir de entonces, se utilizó yoduro de propidio (PI, Sigma) para la detección de células inmortalizadas. Las células se evaluaron con un citómetro de flujo (Becton Dickinson FACS Calibur) y la distribución de las células se analizó con el software CellQuest47.

Se cultivaron células de fibroblastos de ratón L-929 en medio COM y se sembraron en placas de cultivo de 96 pocillos. Después de 24 h, las células se trataron usando una concentración de 5 y 40 mg/ml de POS obtenido durante 24 y 48 h. Posteriormente, se realizó el ensayo MTT mencionado para analizar los efectos de citotoxicidad de los compuestos obtenidos46.

Todos los datos analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y sus archivos de materiales complementarios.

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Descargar referencias

Los autores agradecen a la Universidad de Isfahan por el apoyo financiero brindado a un estudiante de EM para un período de capacitación en el Departamento de Biología y Microbiología Celular y Molecular de la Universidad de Isfahan.

Departamento de Biología y Microbiología Celular y Molecular, Facultad de Ciencias y Tecnologías Biológicas, Universidad de Isfahan, Isfahan, 8174673441, Irán

Behnam Ashrafian y Afrouzossadat Hosseini-Abari

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BA: Curación de datos; análisis formal; Investigación; Escribiendo. AHA: Supervisión; Metodología, Redacción: revisión y edición.

Correspondencia a Afrouzossadat Hosseini-Abari.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Ashrafian, B., Hosseini-Abari, A. Investigación de la bioactividad de ácidos oligo-galacturónicos insaturados producidos a partir de desechos de manzana por Alcaligenes faecalis AGS3 y Paenibacillus polymyxa S4 Pectinasas. Informe científico 12, 15830 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-20011-2

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Recibido: 09 julio 2022

Aceptado: 07 septiembre 2022

Publicado: 22 septiembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-20011-2

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